Lon蛋白酶是一種高度保守的AAA+蛋白酶，存在于細(xì)菌、古菌和真核細(xì)胞器中。它在蛋白質(zhì)降解、蛋白質(zhì)質(zhì)量控制、粒線體基因表達(dá)、應(yīng)激響應(yīng)以及其他細(xì)胞事件中都扮演著重要的角色。研究表明Lon與致病細(xì)菌毒力和腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，已成為近年來抗菌和抗癌策略的新靶標(biāo)。
Lon的單體具有3個結(jié)構(gòu)域（N端結(jié)構(gòu)域、AAA+域和蛋白酶域），它通過形成同源六聚體行駛功能。Lon的蛋白水解活性位點位于六聚體的中空腔室中，底物只能通過狹窄的軸向孔進入。張凱銘/李珊珊團隊近年來一直致力于Lon蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能研究，闡明了其N端結(jié)構(gòu)域如何識別底物并使底物去折疊（Sci Adv. 2021a）、ATP酶結(jié)構(gòu)域如何促使底物易位將其送入桶狀降解室（J Biol Chem. 2021）、底物在降解室里如何被水解并作為肽產(chǎn)物釋放（Sci Adv. 2021b）。然而， Lon功能性六聚體的組裝過程仍然未知。
2023年11月13日，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)張凱銘/李珊珊團隊和臺北中央研究院張崇毅團隊合作在Nature communications雜志發(fā)表題為 “A 5+1 assemble-to-activate mechanism of the Lon proteolytic machine”的文章。這項新的研究展示了Lon AAA+蛋白酶的激活過程，包括五聚體組裝和依賴底物的第六個單體插入形成激活態(tài)。
在本次工作中，中科大副研究員李珊珊等人解析了一系列從無底物狀態(tài)到底物結(jié)合狀態(tài)的Lon結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)使得研究人員能夠識別和觀察不同的組裝中間體中每個單體的結(jié)構(gòu)變化。研究揭示了Lon蛋白酶的螺旋性五聚體的重要作用：在沒有底物的情況下，第六個單體會結(jié)合到螺旋五聚體的最低位置，形成具有受阻孔環(huán)的自抑制螺旋六聚體。然而，當(dāng)?shù)孜锎嬖跁r，第6個單體的結(jié)合會形成閉合環(huán)六聚體，這反過來又打開了蛋白水解槽。因此，在Lon蛋白酶的組裝過程中，五聚體與第6個單體底物依賴性的結(jié)合，激活了眾所周知的底物-孔環(huán)接觸的形成，最終形成了功能性六聚體（圖1）。
圖1. Lon蛋白酶的“5+1”組裝-激活機制。
為了驗證這一“5+1”激活模型，研究人員構(gòu)建了Lon的單體突變體（?N-E613K和?N-L708R），這些單體突變體可以與五聚體形式結(jié)合形成螺旋性六聚體而無法形成功能性六聚體，以濃度依賴的方式完全抑制野生型Lon對底物的降解。這些結(jié)果表明，螺旋五聚體，而不是螺旋六聚體，是介導(dǎo)Lon底物依賴性激活的關(guān)鍵介質(zhì)（圖2）。進一步的研究表明，這些突變體在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)，導(dǎo)致了與Lon缺乏相關(guān)的特定表型變化，包括抑制持久性細(xì)胞的形成（圖3）。因此，通過一系列體外和體內(nèi)實驗，研究人員證明了這種“5+1” 組裝-激活機制的功能和生物學(xué)意義。
圖2. Lon的單體突變體結(jié)合到五聚體形式并有效抑制Lon的活性。
Fig. 3. 大腸桿菌細(xì)胞中單體突變體的表達(dá)引發(fā)一系列與Lon deficiency相關(guān)的表型。
綜上，這些研究發(fā)現(xiàn)為AAA+蛋白酶的激活機制提供了一個新的范例，該激活機制是由底物控制的組裝過程誘導(dǎo)的，其中五聚體的中間狀態(tài)在組裝過程中起著至關(guān)重要的作用。這項研究強調(diào)了細(xì)胞內(nèi)蛋白水解機器是如何受到底物存在的嚴(yán)格控制的，如果不受控制，它將具有潛在的破壞性。最后，這項工作還展示了一種抑制細(xì)胞內(nèi)特定AAA+蛋白的新策略，從而阻礙大腸桿菌持久性細(xì)胞的形成。這些結(jié)果可能為靶向抑制細(xì)胞中特定 AAA+ 蛋白的治療應(yīng)用開辟新途徑。
該研究工作獲得了細(xì)胞動力學(xué)教育部重點實驗室、國家自然科學(xué)基金委、科技部、中國科學(xué)院先導(dǎo)等項目的資助，以及獲得了中國科大冷凍電鏡中心及附一院的大力支持。中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)為該工作的第一完成單位，生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部李珊珊副研究員和臺北中央研究院博士后謝侃言為共同第一作者。李珊珊副研究員、張凱銘教授及張崇毅研究員為共同通訊作者。
（文章來源：www.ebiotrade.com/newsf/2023-11） | 
